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分析软件操作手册(Correlation Analysis V3.6)

分析软件操作手册(Correlation Analysis V3.6)

【概要描述】

分析软件操作手册(Correlation Analysis V3.6)

【概要描述】

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CorTector

软件操作手册

Correlation Analysis

V3.6


 

 

目录

1.数据分析流程.... 3

1.1 数据文件的导入.... 3

1.1.1 导入单文件.... 3

1.1.2 导入文件夹.... 5

1.2 数据文件的加载及右键菜单功能... 7

1.2.1 单文件的加载.... 7

1.2.2 多文件的加载.... 8

1.2.3 校准参数的载入.... 10

1.2.4 显示数据采集时的状态信息.... 12

1.2.5 文件的重命名功能.... 15

1.2.6 以Calibration文件的形式载入文件.... 16

1.2.7 快速打开数据文件夹.... 17

1.3 数据通道选择及拟合模型选择.... 17

1.3.1 数据通道选择.... 17

1.3.2 拟合模型的选择.... 19

1.4 拟合与计算.... 20

1.4.1 拟合起始点与终止点的选择.... 20

1.4.2 拟合参数的初始化.... 21

1.4.3 进行拟合与计算分析.... 21

1.4.4 异常数据标记与处理.... 23

1.5 样品数据的分析流程.... 24

2.分析后的数据保存.... 25

2.1 分析数据的保存.... 25

2.2 图像及其绘图数据的保存... 26

2.2.1 对拟合图像及绘图数据的保存.... 26

2.2.2 对归一化图像及坐标数据的保存... 27

2.2.3 对源数据图像及坐标数据的保存... 28

3. 其它功能.... 29

3.1 FCS曲线数据筛查功能... 29

3.2 背景校正功能.... 31

3.3 拟合初始参数修改功能.... 32

附录1:标准荧光分子扩散系数表.... 33

 

1.数据分析流程

1.1 数据文件的导入

使用Correlation Analysis软件可对Correlation Acquisition软件采集的数据进行分析处理。对于数据文件的导入,一般可分为单个文件和整个文件夹的导入两种方式。

1.1.1 导入单文件

点击File->Open选项,通过文件选择框导入指定的数据文件。

图1-1 菜单Open选项

图1-2 文件选择框

选择需要导入的文件后,点击打开,即可将文件导入到界面左侧的文件列表框处,如图1-3所示:

图1-3 导入至文件列表中

 

1.1.2 导入文件夹

点击文件列表框右上角的“···”形式的按钮,如图1-4所示,会弹出文件夹选择框,通过选择指定文件夹,可导入该文件夹下的所有数据文件。导入成功后,如图1-6所示。

图1-4 导入文件夹按钮

图1-5文件夹选择框

图1-6 成功导入指定文件夹下的数据文件

此外,用户可通过文件列表处的下拉菜单,查看最近导入的历史记录,可根据需要进行选择导入对应路径下的文件。

图1-7 下拉菜单可查看历史记录

 

 

1.2 数据文件的加载及右键菜单功能

1.2.1 单文件的加载

成功导入文件后,用户可自行在文件列表中选中需要加载的文件,双击鼠标左键,即可完成对指定数据文件的加载。加载成功后,文件名的前方会有“>>>”样式的标记,如图1-8所示,并且会默认选择数据通道和拟合模型,显示对应的数据图像。

图1-8 文件加载成功的标记

图1-9 文件加载成功后的界面

 

 

1.2.2 多文件的加载

对于多文件的加载,用户在文件列表中可通过按住鼠标左键,进行拖拉框选需要载入的文件,如图1-10所示,也可以按住键盘的Ctrl键根据需要有选择性地进行多选,如图1-11所示。

图1-10 拖拉框选多文件

图1-11 通过Ctrl键有选择性地选择多文件

用户选择完需要加载的文件后,在文件列表处点击鼠标右键唤出右键菜单,通过菜单中的“Batch Load”来完成多文件的载入。

图1-12 通过右键菜单的Batch Load载入多文件

同样地,成功加载后,文件名前都会有“>>>”样式的标记,如图1-13所示,并且“Data”区域的上方处会出现下拉菜单,用户可通过该菜单对载入的文件进行切换,并进行后续操作。

图1-13 载入多文件后的标记和文件切换

 

1.2.3 校准参数的载入

实验数据分析前需要载入分析后的标准荧光分子数据作为校准参数,载入的方式有两种,一种是校准文件已导入至文件列表,选中文件后,通过右键菜单中的“Load Calibration Parameters”来载入校准参数,载入成功后,在“Fitting Parameters”表格上方的按钮会变为绿色,并且当鼠标指针悬停在按钮上会显示对应通道的校准文件路径信息,如图1-15所示,用户可根据需要勾选固定/放开的参数再进行后续的拟合操作。

图1-14 通过右键菜单载入校准文件

图1-15 成功载入校准文件后的界面

而另一种就是通过“Fitting Parameters”表格上方的“Load Calibration Parameters”按钮来载入校准文件,如图1-16所示,点击后,选择相应的文件即可。这种方式可以载入指定路径的校准文件,载入成功后,同样地会出现可固定的参数,默认固定参数S,并且将S及其error值更新至表格中。

图1-16 通过Load CalibrationParameters按钮来载入校准文件

图1-17 Load Calibration Parameters文件选择框

 

1.2.4 显示数据采集时的状态信息

在分析数据时,若需要查看数据采集时的仪器状态参数,此时可在文件列表中选中一个需要查看状态的文件后,通过右键菜单中的“Display Instrument Status”即可查看对应文件在采集数据时的状态信息,该消息会显示在界面的右方。如图1-18所示。

图1-18 通过右键菜单查看状态信息

上述方式主要是针对未载入数据文件,直接在文件列表中操作查看数据文件在采集时的状态信息,若已载入数据文件,用户可以通过界面上方的“Instrument Status >>”按钮直接显示状态信息,并且可以通过“Instrument Status Hide <<”按钮来隐藏状态信息的界面。

图1-19 状态信息显示按钮

图1-20 状态信息隐藏按钮

此外,载入数据后,用户可根据个人习惯,可通过文件列表处的按钮对该区域进行隐藏/显示,若下图所示:

图1-21 文件列表隐藏按钮

图1-22 文件列表隐藏后的界面

 

1.2.5 文件的重命名功能

在文件列表中,用户可对导入的文件进行重命名,具体操作是,选中需要重命名的文件,右键选择“Rename”,在弹出的框中的“New Name”项填入修改的文件名,点击“OK”即可修改,并且会更新至文件列表中。

图1-23 右键菜单的Rename选项

图1-24 Rename命名框

图1-25 重命名后更新至文件列表

1.2.6 以Calibration文件的形式载入文件

新版的数据文件在载入时,会自动区分文件类型,但对于旧版的数据文件,用户需要自行区分。在文件列表中,选中需要进行分析的旧版校准文件,在右键菜单中选择“Load as Calibration File”,即可进行加载。

图1-26 以Calibration文件形式加载

载入文件后,需要用户手动选择荧光校准因子后,方可进行正常的拟合和计算操作。

图1-27 选择荧光校准因子

1.2.7 快速打开数据文件夹

在文件列表中右键唤出菜单,选中“Show in Explorer”选项,可以打开数据文件所在的文件夹。

图1-28 Show in Explorer选项

 

1.3 数据通道选择及拟合模型选择

1.3.1 数据通道选择

成功载入数据后,软件会根据数据采集时所用的探测器,选择默认的数据通道,在数据通道选择区域,用户可以点击查看各通道的源数据及光强的图像、均值图像。

图1-28 数据通道选择区域

图1-29 源数据及其均值图像的显示

图1-30 光强及其均值图像的显示

1.3.2 拟合模型的选择

同样地,在载入数据后,软件会选择默认的拟合模型“Single 3D Diffusion + Triplet Dynamics”,当然用户可以根据实际情况,在该区域的下拉菜单处选择需要的拟合模型。

图1-31 拟合模型显示区域

图1-32 拟合模型选择

 

1.4 拟合与计算

1.4.1 拟合起始点与终止点的选择

当确认好数据通道与拟合模型时,用户可点击“Fit”按钮,此时,出现默认选点提示框,点击“Yes”将以默认点进行拟合,若点击“No”,则重新选点。如下图:

图1-33 点击Fit按钮后出现默认选点提示框

重新选点时,将鼠标移至图像区域,指针会变成十字标,用户点击即可选择,选择起始点后,用户可按住“Alt”键不放,继续选择终止点,当然,若不选择终止点,软件会给予一个默认的终止点。

图1-34 选择起始点与终止点

 

1.4.2 拟合参数的初始化

在选择拟合起始点时,可看见表格出现默认的初始化参数,用户可根据拟合需要,通过表格上方的复选框,勾选需要固定的校准参数,勾选后,参数会固定至表格中,如下图展示了固定S、TauT的情况:

图1-35 固定拟合参数至表格中

 

1.4.3 进行拟合与计算分析

待确认完拟合点和初始参数后,再次点击“Fit”按钮即可进行拟合与计算的操作。拟合完成后,会弹出提示框,如下图所示:

图1-36 拟合完成提示

拟合完成后,用户可点击“Fitting Parameters”表格中的单元格(可多选),查看对应行数据的曲线图像,并且可用鼠标单击或框选图像区域进行放大,双击即恢复正常比例。

图1-37 查看数据图像

现在,用户可通过曲线图像下方的Legend表格,点击曲线图例即可对对应的曲线进行高亮显示。

图1-38 放大并高亮显示数据曲线

同样地,用户若需重新选择拟合点,可在拟合完成后再次按“Fit”按钮,在弹出的提示框中,点击“No”即可重新选点。

此外,对于多文件载入的拟合计算处理,用户通过“Batch Load”操作后,可选择通道选择区域上方下拉菜单中的“Show all the curves”项,再点击“Fit”按钮即可进行多文件的自动拟合;当然,用户也可以在进行完一个文件的拟合和计算后,在“Data”栏的上方下拉菜单,对各文件进行切换,再手动进行下一个文件的拟合和计算,或者查看已拟合好的其它文件。

图1-39多文件的切换

 

1.4.4 异常数据标记与处理

拟合完成后,用户若对某行数据不满意,可选中表格对应行的单元格,右键唤出菜单后点击“Mark”选项,即可对对应行的数据进行标记,并且可标记多行数据;重新拟合时,软件自动忽略该行的数据进行拟合。当然,用户若标记有误,可选择“Unmark”进行取消标记。若点击的是“Delete”选项,则可删除所选行的拟合数据以及对应曲线。

图1-40 右键菜单对表格数据进行标记

图1-41 标记多行后的表格

 

1.5 样品数据的分析流程

在以上章节中,对软件的基本操作做了介绍,对于标准荧光分子的数据文件的分析,直接载入文件进行拟合操作即可;而对于样品数据文件则需要在分析之前,确保已载入校准参数,而校准参数来自于已分析的标准荧光分子的数据文件,通过上述的“Load Calibration Parameters”操作即可完成校准参数的载入。

 

2.分析后的数据保存

2.1 分析数据的保存

完成分析后,用户可点击菜单栏中的File->Save选项,在弹出的文件保存框对已分析的数据进行保存。

图2-1 菜单栏的Save选项

图2-2 Save文件保存框

通过上图中的文件保存界面,用户可以选择本次载入分析的文件进行保存,其中,用户可通过表格中的“Select”列复选框选择需要保存的文件;在“File Name”列中,软件会给予默认的保存文件名,用户可以直接在表格中修改文件名;而在“Type”列中,则提供保存的文件类型,包括mat、xls、txt三种格式(注:由于数据量大,加上txt本身特性,保存txt格式的文件可读性差,建议使用其余两种格式保存文件)。而在表格下方的Path栏中,用户可点击右方的文件夹图标,进行保存文件路径的选择,确认上述信息后,点击Save方可保存。

此外,菜单栏中的File->Save All选项,保存方式与Save功能一致,该功能项的不同之处在于,Save All可以保存非当前分析的文件,也就是说,用户可以进行多批次的文件分析后,最后对文件进行统一保存。

对于已保存的文件,用户可通过以载入数据文件的方式,对已分析的文件进行载入,这样就可以对已分析的文件进行查阅。

 

2.2 图像及其绘图数据的保存

2.2.1 对拟合图像及绘图数据的保存

拟合完成后,用户在表格中点击需要保存的图像或绘图数据所对应行,然后点击界面右上角的“Save Results”按钮,在弹出的界面中,用户可自行选择需要保存的数据、范围、类型等,确认保存的路径和文件名后点击“Save”即可保存。

图2-3 Save Results按钮

图2-4 Save Results界面

2.2.2 对归一化图像及坐标数据的保存

对于归一化图像及其数据的保存,用户在需要点击界面右上角的“Normalization”按钮进行归一化操作,然后点击“Save Results”方可进行保存。

图2-5 进行归一化操作

图2-6 选取0.01(ms)至0.1(s)区间保存图像

 

2.2.3 对源数据图像及坐标数据的保存

对于源数据的图像及其数据的保存,用户只需在“Data”区域,点击选择需要保存的源数据通道(Raw Correlation或Intensity),再点击“Save Results”即可进行保存。

图2-7 通道选择区域

 

 

3. 其它功能

3.1 FCS曲线数据筛查功能

在软件界面的右上方点击“Data Screening”按钮,可进入数据筛查模式,该模式允许用户对某些不合理的FCS曲线进行剔除,仅保留余下的数据进行分析。

图3-1 Data Screening按钮

图3-2 进入筛查曲线模式

在弹出的提示框中点击“OK”后,用户可在图像显示区域,选择需要删除的曲线(可选多条),可通过单击对曲线进行选中/取消选中,此外,用户可点击曲线附近的空白处对图像进行放大。选中后,点击右上角“Delete Curve”按钮,即可对曲线进行删除。用户若误删了曲线,只需重新加载文件即可恢复。

图3-3 选中需要删除的曲线

图3-4 放大后选中多条曲线

 

3.2 背景校正功能

在菜单栏中选择“Background Correction”项,可导入背景文件,成功导入后,菜单栏会显示背景文件的路径并以绿色字体显示,此时,图像显示区域会显示背景文件的光强。背景扣除功能使用的先决条件一般为:背景缓冲液存在较强的荧光信号,但一般不超过待测样品荧光强度的5%,且不存在自相关性。

图3-5 成功导入背景文件

导入背景文件后,此时,用户在文件列表中载入文件均会对原始数据进行背景数据的扣除。

此外,用户可通过再次点击菜单栏中的“Background Correction”项来退出背景扣除状态。

 

3.3 拟合初始参数修改功能

在菜单栏的“Edit”项中,点击“Parameter Editing”选项可开启或关闭参数编辑功能;当标记为“√”时表示开启,反之表示关闭。

图3-6 Parameter Editing

开启参数编辑功能后,用户即可在拟合参数表格中,选中需要修改的拟合初参的“Mean”行数据,输入指定初值,输入后按下回车键即可完成修改,再次拟合时,软件会根据你所设置的初参进行拟合。此外,若需要重新使用校准文件的参数作为拟合初参,则只需重新执行“Load Calibration Parameters”操作即可。

图3-7 修改T值拟合初始参数

 

 

 

附录1:标准荧光分子扩散系数表

Fluorophore

λEm (nm)

Diffusion coefficient

 (μm2 s-1)

Methods

Atto655-maleimid

686

 407 ± 10

2fFCS, PFG-NMR

406 ± 9

2fFCS

409 ± 7

pmFCS

Atto655-carboxylic acid

685

426 ± 8

2fFCS, PFG-NMR

Atto655-NHS esther

685

425 ± 6

2fFCS

Atto488-carboxylic acid

523

400 ± 10

2fFCS

Cy5

670

360 ± 10

2fFCS

Alexa 647

665

330 ± 10

2fFCS

Alexa 633

647

340 ± 10

2fFCS

Alexa 546*

572

341

2fFCS

Alexa 488*

520

435

2fFCS

eGFP*

510

95

2fFCS

Rhodamine 6G

550

414 ± 5

2fFCS

 430 ± 40

PFG-NMR

414 ± 1

PB/CF

Rhodamine 123

530

460 ± 40

PFG-NMR

Rhodamine 110

535

470 ± 40

PFG-NMR

Fluorescein

520

425 ± 1

PB/CF

Oregon Green 488

550

411 ± 6

2fFCS

410 ± 8

TetraSpeck Beads,

0.1μm diameter

430

4.4 ± 7.0

2fFCS, DLS

515

580

680

 

Diffusion coefficients measured in water solutions at 25℃ (298.15 K), except for those marked with *, which were obtained at 22.5℃ (295.65 K).

Abbreviations of measurement methods.

2fFCS. Dual Focus Fluorescence Correlation Spectroscopy:

PFG-NMR, Pulsed Field Gradient Nuclear Magnetic Resonance:

pmFCS, Polarization-Modulation Fluorescence Correlation Spectroscopy;

PB/CF, Plug Broadening/Capillary Flow;

DLS. Dynamic Light Scattering.

 

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